概要：脂質納米顆粒（LNPs）是一種具有均勻脂質核的脂囊泡，被廣泛應用于小分子藥物和核酸輸送，最近因為在COVID-19 mRNA疫苗遞送平臺取得的顯著成功引起了廣泛的關注。然而，mRNA誘導的短暫蛋白表達的應用并不僅僅用于傳染性疾病的疫苗領域，也為癌癥疫苗、蛋白質替代療法和罕見遺傳疾病的基因編輯組件提供了新的途徑。然而，未包覆的mRNA本身并不穩定，很容易由于核酸酶和自水解快速降解。經LNPs包覆的mRNA可以免受細胞外核糖核酸酶的影響，并有助于細胞內mRNA的遞送。在這篇(pian)文章(zhang)中(zhong)，我們將(jiang)討論RNA遞送所使用LNPs的核心特征。本文將(jiang)聚焦于(yu)mRNA遞送用LNPs；然(ran)而，也(ye)相(xiang)應地列(lie)舉了(le)siRNA-LNP遞送的例子，以(yi)突出核酸結構造成的共性(xing)和(he)差(cha)異。首(shou)先(xian)，將介(jie)紹LNPs的(de)(de)(de)(de)概念(nian)，利用核酸作(zuo)為治(zhi)療藥物的(de)(de)(de)(de)優點(dian)和缺點(dian)，以(yi)(yi)及LNPs分(fen)子(zi)構成(cheng)的(de)(de)(de)(de)一(yi)般推(tui)理(li)；同時(shi)簡要介(jie)紹了臨床上(shang)基于LNPs的(de)(de)(de)(de)核酸治(zhi)療的(de)(de)(de)(de)最新成(cheng)功經驗。其(qi)次，闡述了LNP自組裝的(de)(de)(de)(de)理(li)論和方(fang)法。所有(you)(you)制備方(fang)法的(de)(de)(de)(de)共同理(li)念(nian)是誘導(dao)核酸和帶電(dian)(dian)脂質(zhi)之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)靜電(dian)(dian)相(xiang)互作(zuo)用，并通過疏水作(zuo)用促(cu)進納米顆粒的(de)(de)(de)(de)生長。第(di)三，根據基本性(xing)(xing)(xing)(xing)質(zhi)和用途(tu)對(dui)LNP進行成(cheng)分(fen)分(fen)解，包括公認的(de)(de)(de)(de)分(fen)子(zi)設計(ji)標準(zhun)、商業來源，對(dui)細胞內運輸的(de)(de)(de)(de)影響(xiang)，以(yi)(yi)及對(dui)LNPs性(xing)(xing)(xing)(xing)能(neng)的(de)(de)(de)(de)貢獻(xian)。LNPs的(de)(de)(de)(de)關鍵(jian)成(cheng)分(fen)之一(yi)是啟動與(yu)內吞體(ti)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)靜電(dian)(dian)結(jie)合、并促(cu)進胞質(zhi)釋放的(de)(de)(de)(de)可電(dian)(dian)離脂質(zhi)；然而，其(qi)他脂質(zhi)成(cheng)分(fen)的(de)(de)(de)(de)作(zuo)用也不應忽視(shi)，因為它們與(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)穩定性(xing)(xing)(xing)(xing)、間(jian)(jian)隙和分(fen)布密切相(xiang)關。第(di)四，從(cong)整體(ti)上(shang)回顧(gu)了對(dui)RNA遞送(song)有(you)(you)重要影響(xiang)的(de)(de)(de)(de)LNP結(jie)構屬性(xing)(xing)(xing)(xing)，包括LNP的(de)(de)(de)(de)尺寸、電(dian)(dian)荷、內部結(jie)構、脂質(zhi)封裝、脂膜(mo)水合作(zuo)用、穩定性(xing)(xing)(xing)(xing)和對(dui)生物大分(fen)子(zi)的(de)(de)(de)(de)親和性(xing)(xing)(xing)(xing)；還(huan)將討論這些屬性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)檢測技術以(yi)(yi)及調控方(fang)法。最(zui)后(hou)，展望了RNA療(liao)法的未來，并(bing)提出了LNP配(pei)方和優化(hua)領域中(zhong)存在的一(yi)些問題。

 

1.引(yin)言

近年來，脂(zhi)質(zhi)納米顆(ke)粒(li)（LNPs）顯示其在(zai)RNA疫(yi)苗和療法中(zhong)作(zuo)為(wei)遞送系統的(de)(de)的(de)(de)實用(yong)性。無包覆的(de)(de)RNA是一(yi)種帶(dai)負(fu)電(dian)荷的(de)(de)親水大分子，由于(yu)細(xi)胞膜(mo)的(de)(de)靜(jing)電(dian)排(pai)斥，很難進(jin)入(ru)(ru)細(xi)胞，并(bing)被無所不在(zai)的(de)(de)核糖核酸酶(mei)（RNase）迅速降(jiang)解。因(yin)此(ci)(ci)(ci)，它需要(yao)一(yi)個保(bao)護(hu)層(ceng)以增加(jia)進(jin)入(ru)(ru)細(xi)胞內(nei)部(bu)機會(hui)。由于(yu)細(xi)胞膜(mo)主要(yao)由脂(zhi)質(zhi)構成(cheng)，因(yin)此(ci)(ci)(ci)，使用(yong)脂(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)包覆RNA可(ke)以使RNA更容易通過細(xi)胞膜(mo)并(bing)將(jiang)其釋放到細(xi)胞質(zhi)中(zhong)。為(wei)了(le)(le)實現這個目的(de)(de)，脂(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)首(shou)先需要(yao)一(yi)個帶(dai)正(zheng)電(dian)的(de)(de)脂(zhi)粒(li)，可(ke)以附著在(zai)帶(dai)負(fu)電(dian)的(de)(de)RNA上(shang)。然(ran)而(er)，由永久性陽離子脂(zhi)粒(li)組成(cheng)的(de)(de)脂(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)會(hui)對帶(dai)負(fu)電(dian)荷的(de)(de)細(xi)胞膜(mo)產生靜(jing)電(dian)破壞從而(er)引起細(xi)胞毒(du)性。因(yin)此(ci)(ci)(ci)，脂(zhi)質(zhi)結構被進(jin)一(yi)步改進(jin)，通過酸性內(nei)溶(rong)酶(mei)體(ti)(ti)途徑獲得正(zheng)電(dian)荷；LNP成(cheng)分也擴(kuo)展到了(le)(le)結構脂(zhi)類(lei)(lei)（模擬細(xi)胞膜(mo)并(bing)屏蔽正(zheng)電(dian)荷）和聚（乙二(er)醇）-錨(mao)定脂(zhi)類(lei)(lei)（防止LNPs聚集以及(ji)與生物環境的(de)(de)副反(fan)應）。從FDA批準(zhun)了(le)(le)首(shou)個siRNA-LNP藥物（Onpattro）和mRNA-LNP新冠(guan)疫(yi)苗（Comirnaty）以及(ji)Moderna新冠(guan)疫(yi)苗的(de)(de)緊急使用(yong)授權(quan)（EUA）等這些該領域的(de)(de)主要(yao)監管里程碑事件可(ke)以明顯看出，基于(yu)LNP的(de)(de)核酸遞送方法是安全的(de)(de)，適用(yong)于(yu)各種療法。然(ran)而(er)，目前還沒有(you)適合所有(you)疾病的(de)(de)萬(wan)能(neng)方案，因(yin)此(ci)(ci)(ci)LNP的(de)(de)優化工作(zuo)依舊任(ren)重道遠(yuan)。本文將(jiang)討論用(yong)于(yu)選擇(ze)RNA-LNP遞送脂(zhi)類(lei)(lei)所需的(de)(de)主要(yao)科學和制造概念。

2.制備

LNP的(de)(de)(de)(de)制(zhi)備依(yi)賴(lai)于(yu)自(zi)(zi)組裝能(neng)力(li)，即脂(zhi)質(zhi)成分(fen)在(zai)分(fen)子間(jian)(jian)相互(hu)作用的(de)(de)(de)(de)基礎上自(zi)(zi)發組裝成納米(mi)實體。LNP的(de)(de)(de)(de)形成從帶負(fu)電荷的(de)(de)(de)(de)核酸(suan)和帶正(zheng)電荷的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)類之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)靜電結(jie)合(he)(he)開始(shi)。然(ran)后(hou)，LNPs通過(guo)疏水性和脂(zhi)質(zhi)組分(fen)之間(jian)(jian)相互(hu)作用的(de)(de)(de)(de)范德華力(li)增(zeng)長(chang)。由于(yu)脂(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)多樣性、核酸(suan)的(de)(de)(de)(de)獨特性及兩(liang)者(zhe)混合(he)(he)過(guo)程(cheng)的(de)(de)(de)(de)瞬時(shi)性，對自(zi)(zi)組裝的(de)(de)(de)(de)早期(qi)階段及其對LNP最終性質(zhi)的(de)(de)(de)(de)相關影響(xiang)的(de)(de)(de)(de)表征仍然(ran)極具挑(tiao)戰。此外，LNP制(zhi)造協議至少在(zai)兩(liang)個方面影響(xiang)產(chan)品(pin)的(de)(de)(de)(de)自(zi)(zi)組裝: LNPs的(de)(de)(de)(de)均勻性和核酸(suan)負(fu)載效率。

LNP有(you)多種制備(bei)方法(fa)(fa)，如脂(zhi)(zhi)膜泡擠出法(fa)(fa)、脂(zhi)(zhi)膜再水(shui)化、納米沉淀法(fa)(fa)和(he)(he)微流體(ti)混合(he)(he)(he)法(fa)(fa)。然而，通常的(de)(de)(de)(de)(de)(de)制備(bei)方法(fa)(fa)是將(jiang)(jiang)水(shui)和(he)(he)脂(zhi)(zhi)質組(zu)分快(kuai)速混合(he)(he)(he)。微流控技術(shu)以其良好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)重復性(xing)而成(cheng)為當前臨(lin)床前研(yan)究的(de)(de)(de)(de)(de)(de)首選方法(fa)(fa)。新(xin)型(xing)微流控設備(bei)制造取得(de)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)進展(zhan)使這種方法(fa)(fa)更(geng)容易(yi)實(shi)現，采(cai)用平行微流體(ti)通道或改進的(de)(de)(de)(de)(de)(de)傳統方法(fa)(fa)（如移(yi)液管混合(he)(he)(he)和(he)(he)t型(xing)混合(he)(he)(he)器）等其他途徑也可以實(shi)現LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)通量制備(bei)。一般來(lai)講，微流體(ti)混合(he)(he)(he)有(you)利于將(jiang)(jiang)親水(shui)性(xing)部分封(feng)裝到(dao)疏(shu)水(shui)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質核(he)心(xin)中，但這一過程(cheng)并不能嚴格需要核(he)酸的(de)(de)(de)(de)(de)(de)參與。Kulkarni等報道，只(zhi)要脂(zhi)(zhi)質核(he)心(xin)形成(cheng)，LNPs可以在T型(xing)混合(he)(he)(he)器內(nei)與siRNA完成(cheng)組(zu)裝。總的(de)(de)(de)(de)(de)(de)來(lai)說，混合(he)(he)(he)方式的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特(te)性(xing)可能會影響(xiang)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)裝效(xiao)率和(he)(he)內(nei)部結構(gou)，而自組(zu)裝過程(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)動力學(xue)因(yin)數則會決定最終的(de)(de)(de)(de)(de)(de)納米結構(gou)。

3.配方

3.1陽離子和可電離脂質

陽離(li)子脂(zhi)質（CLs）和(he)可電(dian)離(li)脂(zhi)質（ILs）通過(guo)靜電(dian)相互作用啟動自(zi)組裝的(de)(de)第一步。含有CLs的(de)(de)脂(zhi)質體仍被(bei)廣泛用于(yu)核酸遞送。然(ran)而(er)，由于(yu)毒性(xing)(xing)問題(ti)和(he)缺乏體內療效，它們已被(bei)對pH敏(min)感的(de)(de)ILs所取代。當(dang)被(bei)配制(zhi)成LNPs時，ILs被(bei)設計成在(zai)(zai)生理pH下(xia)顯示電(dian)中(zhong)性(xing)(xing)，但在(zai)(zai)酸性(xing)(xing)核內體內則表現為(wei)帶正電(dian)荷。這(zhe)種(zhong)pH適應的(de)(de)電(dian)離(li)性(xing)(xing)使其功效提升同時毒性(xing)(xing)降低，從而(er)更適合(he)于(yu)核酸遞送。這(zhe)些脂(zhi)類通常(chang)占配方中(zhong)總脂(zhi)類的(de)(de)30-50%。許多研究致力于(yu)微調ILs的(de)(de)屬性(xing)(xing)，以(yi)進一步提高效率，特別是在(zai)(zai)難以(yi)觸(chu)及(ji)的(de)(de)組織。CLs和(he)ILs的(de)(de)整體結構可以(yi)分為(wei)三(san)個部分：（1）頭(tou)基(ji)、（2）連(lian)接體及(ji)（3）尾部（圖(tu)1）。

圖(tu)1 CLs和ILs結構(gou)及組件(jian)（頭(tou)基(ji)、連(lian)接體(ti)及尾部）示意(yi)圖(tu)

頭(tou)基(ji)(ji)(ji) ILs的(de)頭(tou)基(ji)(ji)(ji)通(tong)常帶正電荷。頭(tou)基(ji)(ji)(ji)的(de)大(da)小和電荷密度對(dui)核(he)(he)酸包(bao)(bao)覆、LNP穩定、與細胞膜相互作用(yong)(yong)以及促進(jin)核(he)(he)內(nei)體中的(de)釋放有(you)重(zhong)要(yao)作用(yong)(yong)。ILs也可(ke)能(neng)有(you)多個可(ke)電離的(de)頭(tou)基(ji)(ji)(ji)，盡(jin)管(guan)通(tong)常情況下只有(you)一個。典型(xing)的(de)基(ji)(ji)(ji)包(bao)(bao)括胺（從一級到(dao)四級）、胍和雜環群 （見(jian)圖1）。臨(lin)床應(ying)用(yong)(yong)的(de)ILs（DLin-MC3-DMA、SM-102和ALC-0315；見(jian)圖2）包(bao)(bao)含具(ju)有(you)pH適應(ying)電離性(xing)的(de)叔胺頭(tou)基(ji)(ji)(ji)。ALC-0315和SM-102頭(tou)基(ji)(ji)(ji)中也含有(you)末端羥基(ji)(ji)(ji)，可(ke)以減少頭(tou)基(ji)(ji)(ji)的(de)水合(he)作用(yong)(yong)，并提高(gao)其與核(he)(he)酸的(de)氫鍵作用(yong)(yong)，可(ke)能(neng)會提高(gao)轉染能(neng)力。

圖(tu)2 特(te)定ILs結構及cpKa和cLogP值

 

連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)體(ti) 連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)體(ti)通(tong)常(chang)(chang)連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)頭基與(yu)尾(wei)部，也可(ke)(ke)能(neng)(neng)包(bao)含(han)在尾(wei)部內(nei)（SM-102和(he)(he)(he)ALC-0315；見圖(tu)2）。連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)體(ti)會(hui)影響LNPs的(de)(de)(de)穩(wen)定性(xing)(xing)、生物(wu)(wu)降解性(xing)(xing)、細胞(bao)毒性(xing)(xing)和(he)(he)(he)轉(zhuan)染效率。在CLs和(he)(he)(he)ILs設(she)計中(zhong)使用的(de)(de)(de)常(chang)(chang)用連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)器如圖(tu)1所示。ILs可(ke)(ke)能(neng)(neng)包(bao)含(han)一個(ge)或多個(ge)連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)體(ti)；然而，為了便于(yu)合成，大多數ILs只含(han)有(you)一種類(lei)型的(de)(de)(de)連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)體(ti)。連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)體(ti)可(ke)(ke)分為不可(ke)(ke)生物(wu)(wu)降解型（如醚類(lei)和(he)(he)(he)氨(an)基甲酸酯(zhi)類(lei)）和(he)(he)(he)可(ke)(ke)生物(wu)(wu)降解型（如酯(zhi)類(lei)、酰胺類(lei)和(he)(he)(he)硫醇(chun)類(lei)）。生物(wu)(wu)可(ke)(ke)降解連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)體(ti)由于(yu)可(ke)(ke)在體(ti)內(nei)被(bei)(bei)快(kuai)速清除，通(tong)常(chang)(chang)被(bei)(bei)作為首選，以確保多次給藥并減少潛在的(de)(de)(de)副作用。值得注意(yi)的(de)(de)(de)是(shi)，DLin-MC3-DMA，ALC-0315和(he)(he)(he)SM-102都含(han)有(you)酯(zhi)類(lei)連(lian)(lian)(lian)接(jie)(jie)(jie)體(ti)。對于(yu)SM-102，酯(zhi)基團(tuan)周圍的(de)(de)(de)修飾被(bei)(bei)證實會(hui)影響LNPs的(de)(de)(de)清除、穩(wen)定性(xing)(xing)和(he)(he)(he)轉(zhuan)染效率。

尾(wei)部(bu) 疏水性(xing)的(de)(de)(de)尾(wei)部(bu)會影響pKa、親(qin)脂性(xing)、流動性(xing)和融合性(xing)，從而(er)影響納米顆粒的(de)(de)(de)形成和效(xiao)力。通常，一個(ge)IL包含(han)1到(dao)4個(ge)由8到(dao)20個(ge)碳(tan)原子組成的(de)(de)(de)飽和或不(bu)飽和的(de)(de)(de)疏水性(xing)尾(wei)部(bu)。不(bu)飽和程度已被(bei)證(zheng)明通過調節膜不(bu)穩(wen)定(ding)相關方面影響核(he)酸的(de)(de)(de)遞送。DLin-MC3-DMA有(you)兩條亞油基尾(wei)部(bu)，而(er)ALC-0315和SM-102包含(han)兩個(ge)假定(ding)為錐形的(de)(de)(de)分叉飽和尾(wei)部(bu)，有(you)助于對核(he)內體膜的(de)(de)(de)去穩(wen)定(ding)作用(yong)和核(he)酸在細胞溶質的(de)(de)(de)釋放。

ILs可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)被看作是多組分(fen)分(fen)子，其(qi)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)每個(ge)(ge)(ge)部(bu)分(fen)都需要(yao)被精(jing)確設計(ji)(ji)，以(yi)(yi)便安全、高效(xiao)(xiao)地包覆和遞送核酸。從整(zheng)體上理解ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特性(xing)也有助于設計(ji)(ji)下(xia)一(yi)代(dai)(dai)(dai)ILs。這(zhe)些性(xing)質(zhi)(zhi)之(zhi)一(yi)是計(ji)(ji)算出的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa（cpKa），可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)很(hen)容易(yi)地在(zai)硅中確定。常(chang)見(jian)ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa值(zhi)在(zai)9到10.5之(zhi)間(jian)（圖(tu)2）。最近(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)項研究表明，cpKa極(ji)度接近(jin)IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實際pKa. ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa似(si)乎影響(xiang)相應(ying)LNP配方的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)整(zheng)體pKa，這(zhe)樣(yang)當IL 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa大約(yue)是8.5−10.5時(shi)，LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa值(zhi)約(yue)為(wei)6−7。IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa和LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)差值(zhi)似(si)乎是固定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，約(yue)等于2 - 4個(ge)(ge)(ge)單位(wei)。因(yin)此，cpKa可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)作為(wei)新ILs產品設計(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)指導工具。ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)另(ling)外兩個(ge)(ge)(ge)不太(tai)被關注的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)質(zhi)(zhi)是cLogP和cLogD值(zhi)，它(ta)們分(fen)別代(dai)(dai)(dai)表分(fen)子在(zai)非電離(li)態和電離(li)態下(xia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)親(qin)油(you)性(xing)。在(zai)最近(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)項研究中，Rajappan等考(kao)察(cha)了(le)pKa、cpKa和cLogD對LNPs遞送siRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響(xiang)，發現(xian)cLogD在(zai)10 - 14范(fan)圍內(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂質(zhi)(zhi)效(xiao)(xiao)果(guo)最好。因(yin)為(wei)一(yi)些常(chang)見(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cLogP值(zhi)在(zai)15−20范(fan)圍內(nei) （圖(tu)2），在(zai)設計(ji)(ji)下(xia)一(yi)代(dai)(dai)(dai)ILs時(shi)也應(ying)考(kao)慮其(qi)親(qin)油(you)性(xing)性(xing)。由于電離(li)度（cpKa）和親(qin)油(you)性(xing)（cLogP） IL可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)影響(xiang)從最初的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)與核酸形成復雜結構到最終納米粒子形成以(yi)(yi)及核酸遞送的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)整(zheng)個(ge)(ge)(ge)流(liu)程(cheng)，在(zai)合成IL前同時(shi)考(kao)慮這(zhe)兩個(ge)(ge)(ge)參(can)數可(ke)(ke)(ke)能(neng)會極(ji)大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)推動高效(xiao)(xiao)IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)發現(xian)。不過(guo)，需要(yao)更多的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究來印證這(zhe)一(yi)觀點。

除了傳統的(de)(de)CLs和ILs外，還有一些兩(liang)性(xing)離子脂類的(de)(de)例子。在(zai)最近的(de)(de)一項研(yan)(yan)究中，Liu等人合成(cheng)了一個(ge)(ge)名為(wei)iPhos的(de)(de)超過500種兩(liang)性(xing)離子脂質的(de)(de)庫(ku)。這些iPhos由一個(ge)(ge)胺基、短(duan)疏水性(xing)尾部(bu)和一個(ge)(ge)磷酸鹽連(lian)接體(ti)組成(cheng)。研(yan)(yan)究認為(wei)，帶負電荷(he)的(de)(de)磷酸基促進了膜(mo)融合，并導致核(he)內體(ti)釋放。最優(you)的(de)(de)9A1P9的(de)(de)各種配方(fang)可以優(you)先將目標核(he)酸輸送到肝臟(zang)和肺部(bu)。

綜上所述，ILs各(ge)部分的(de)(de)性(xing)質影(ying)響整體(ti)配方和生物(wu)學特性(xing)。過去50年間，為設計出理(li)想(xiang)的(de)(de)IL已(yi)經(jing)(jing)有(you)了許(xu)多系(xi)統(tong)的(de)(de)研究。其中一(yi)些ILs已(yi)經(jing)(jing)被FDA批準(zhun)用(yong)于基因(yin)制(zhi)劑的(de)(de)遞送。然而，設計能夠(gou)在非(fei)肝(gan)靶(ba)上高效(xiao)無毒地輸(shu)送不(bu)同(tong)類型的(de)(de)基因(yin)制(zhi)劑的(de)(de)ILs仍需大量研究。對ILs合成有(you)更多興趣的(de)(de)讀者可(ke)以參考一(yi)篇優(you)秀的(de)(de)相關綜述。

 

3.2固醇類

圖(tu)3 LNP配(pei)方中使(shi)用的固醇（綠色）、磷脂(zhi)（藍色）和PEG脂(zhi)質 （紅(hong)色）舉(ju)例(li)

3.3磷(lin)脂類

磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)有(you)助于(yu)(yu)核酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)封裝和(he)(he)LNPs穩(wen)定性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)提高。與(yu)其他脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類成分(fen)相比，它(ta)們(men)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究相對(dui)較(jiao)少，通(tong)常(chang)只占配方中(zhong)總脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)10 - 20%。磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)因為(wei)可以(yi)自發(fa)地組織(zhi)成脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)雙分(fen)子層，并且具(ju)有(you)較(jiao)高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相變溫度從而確保LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)穩(wen)定性(xing)(xing)而被用作結構(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)。磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)位于(yu)(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)外圍，就像(xiang)細胞(bao)膜(mo)一(yi)(yi)樣。這些脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類通(tong)常(chang)是(shi)(shi)半合成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，例如，磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿通(tong)常(chang)來(lai)自蛋黃和(he)(he)大豆等(deng)天然(ran)來(lai)源，可以(yi)通(tong)過化學(xue)修飾使其包含(han)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪酸(suan)(suan)尾部。二硬脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿 （DSPC）（見(jian)圖3）是(shi)(shi)一(yi)(yi)種(zhong)臨床(chuang)批準的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)LNPs結構(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)，用于(yu)(yu)如siRNA治療（Onpattro）和(he)(he)針對(dui)SARS-CoV-2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA疫苗。DSPC在(zai)(zai)結構(gou)上由磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿頭(tou)基和(he)(he)兩個飽和(he)(he)18碳尾組成，形(xing)成一(yi)(yi)個緊密堆積的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)雙分(fen)子層。在(zai)(zai)LNPs中(zhong)，它(ta)主要(yao)位于(yu)(yu)納米(mi)顆粒(li)表面，同時在(zai)(zai)納米(mi)顆粒(li)核中(zhong)少量存在(zai)(zai)。二油酰磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰乙醇胺（DOPE）是(shi)(shi)另一(yi)(yi)種(zhong)經常(chang)用于(yu)(yu)LNPs臨床(chuang)前研究的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。由于(yu)(yu)尾部不(bu)飽和(he)(he)，DOPE不(bu)僅形(xing)成流動性(xing)(xing)更(geng)好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)層，而且具(ju)有(you)形(xing)成六邊形(xing)II （HII）相結構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)(nei)(nei)在(zai)(zai)能力。HII相結構(gou)被認為(wei)能促進脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)膜(mo)與(yu)核內(nei)(nei)(nei)體膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)融合，進而使核酸(suan)(suan)制劑(ji)在(zai)(zai)胞(bao)質(zhi)內(nei)(nei)(nei)釋放。多項研究表明，與(yu)DSPC相比，DOPE可以(yi)提高率磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基LNPs中(zhong)RNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)染效(xiao)(xiao)率。近期(qi)，Zhang等(deng)人(ren)報(bao)道稱，DOPE可導(dao)致(zhi)C12-200 LNPs在(zai)(zai)肝臟內(nei)(nei)(nei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚集(ji)，而DSPC會導(dao)致(zhi)靜脈給藥(yao)(yao)時脾積聚，證明了結構(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)對(dui)LNP生物分(fen)布的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)。我們(men)還發(fa)現，用天然(ran)糖脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)替代MC3基LNPs中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)DSPC會影(ying)響(xiang)mRNA轉(zhuan)染，來(lai)自植物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)--高絲氨酸(suan)(suan)（DGTS）（見(jian)圖3），可以(yi)根據給藥(yao)(yao)途徑表現出不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)染效(xiao)(xiao)率。總之，這些研究突出了結構(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)在(zai)(zai)LNPs介導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)RNA遞(di)送中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)重要(yao)性(xing)(xing)。

3.4嵌PEG脂質

嵌PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)（PEG-lipids，見(jian)圖3）是控制LNPs半衰(shuai)期和(he)(he)細(xi)胞攝(she)入的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)個(ge)重要(yao)(yao)組成(cheng)(cheng)部(bu)(bu)分。在(zai)LNP組裝過(guo)程中(zhong)(zhong)，PEG鏈(lian)由于(yu)其(qi)親水(shui)性和(he)(he)大(da)(da)體(ti)積(ji)而位于(yu)納(na)米(mi)顆粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)外殼中(zhong)(zhong)。與(yu)其(qi)他納(na)米(mi)載(zai)體(ti)一(yi)樣，PEG為LNPs提供了外部(bu)(bu)聚(ju)合物層，以阻礙血(xue)清蛋白(bai)和(he)(he)單核吞(tun)噬細(xi)胞系(xi)統(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)吸(xi)附，延長體(ti)內循環時(shi)間。PEG還可(ke)(ke)以防(fang)止納(na)米(mi)顆粒(li)在(zai)儲存過(guo)程以及血(xue)液中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)集(ji)。此外，PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)量(liang)(liang)(liang)可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)決定(ding)顆粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)(da)小(xiao)。PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)另一(yi)個(ge)潛在(zai)用(yong)(yong)途(tu)是功能(neng)(neng)(neng)化LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表面，使(shi)(shi)LNPs與(yu)配體(ti)或生物大(da)(da)分子結(jie)(jie)(jie)合成(cheng)(cheng)為可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)。例如(ru)，Singh等使(shi)(shi)用(yong)(yong)DSPE-PEG-胺(an)通(tong)過(guo)NHS/EDC化學共(gong)(gong)軛結(jie)(jie)(jie)合透明(ming)質(zhi)酸來靶向治療腫(zhong)瘤，Parhiz等使(shi)(shi)用(yong)(yong)DSPE-PEG-馬(ma)來酰亞胺(an)通(tong)過(guo)SATA-馬(ma)來酰亞胺(an)化學共(gong)(gong)軛結(jie)(jie)(jie)合抗(kang)體(ti)。雖然PEG有(you)助于(yu)LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩定(ding)性和(he)(he)生物偶聯(lian)，但其(qi)解(jie)吸(xi)對細(xi)胞轉(zhuan)染也(ye)(ye)至(zhi)關重要(yao)(yao)。PEG從(cong)LNPs中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脫落可(ke)(ke)使(shi)(shi)血(xue)清蛋白(bai)（如(ru)載(zai)脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)和(he)(he)白(bai)蛋白(bai)）產生調理作(zuo)用(yong)(yong)，這是LNPs發生受體(ti)介導內吞(tun)作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)關鍵效應物。Akinc等人證明(ming)ApoE與(yu)LNPs結(jie)(jie)(jie)合后，導致低密度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)受體(ti)（LDLR）介導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)肝(gan)(gan)細(xi)胞內化。由于(yu)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)抑(yi)制ApoE與(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)(jie)合，過(guo)量(liang)(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG 脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)會(hui)對LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞攝(she)入和(he)(he)轉(zhuan)染產生不利(li)(li)影(ying)響。含(han)有(you)較少PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)LNPs由于(yu)更容易與(yu)ApoE結(jie)(jie)(jie)合表現出更高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)酸遞送效率。PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)類脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)錨(mao)(mao)(mao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)長度(du)也(ye)(ye)是決定(ding)解(jie)吸(xi)速(su)率的(de)(de)(de)(de)(de)(de)重要(yao)(yao)因素。Mui等報道(dao)了PEG從(cong)LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脫落與(yu)PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)錨(mao)(mao)(mao)定(ding)長度(du)成(cheng)(cheng)反比(bi)，這是因為PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)與(yu)LNP膜之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)疏水(shui)相互(hu)作(zuo)用(yong)(yong)隨著PEG-脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)錨(mao)(mao)(mao)定(ding)長度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加而增加。Suzuki等提出，PEG脫落的(de)(de)(de)(de)(de)(de)速(su)度(du)也(ye)(ye)可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)影(ying)響抗(kang)-PEG抗(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)產生，并(bing)反復(fu)給藥會(hui)引起并(bing)發癥(zheng)。靜脈(mo)給藥LNP配方中(zhong)(zhong)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)量(liang)(liang)(liang)很少超過(guo)2%；然而，密集(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)乙二醇(chun)層可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)有(you)利(li)(li)于(yu)達到肝(gan)(gan)外靶點。Lee等的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究結(jie)(jie)(jie)果顯示，相較2.5%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)含(han)量(liang)(liang)(liang)，5%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)含(han)量(liang)(liang)(liang)時(shi)LNPs在(zai)腫(zhong)瘤中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)積(ji)累(lei)更量(liang)(liang)(liang)高(gao)于(yu)，Lokugamage等的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究表明(ming)，PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)對霧化LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)遞送至(zhi)關重要(yao)(yao)。因此，LNPs中(zhong)(zhong)PEG脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)量(liang)(liang)(liang)和(he)(he)種類可(ke)(ke)能(neng)(neng)(neng)需要(yao)(yao)根(gen)據(ju)臨(lin)床需求謹慎調整(zheng)。

4.性質

LNPs的(de)(de)(de)平均尺寸和(he)尺寸分(fen)布是各種(zhong)(zhong)應(ying)用(yong)(yong)(yong)中LNP質(zhi)量(liang)和(he)適用(yong)(yong)(yong)性的(de)(de)(de)重要(yao)初始決(jue)定因素，這些性質(zhi)通(tong)常用(yong)(yong)(yong)動(dong)態光散(san)射（DLS）來研究。一般來說，LNP的(de)(de)(de)最佳尺寸為20 - 200nm，因為這個尺寸使其(qi)在流體（如血液和(he)淋巴）中足夠穩(wen)定，同時(shi)能夠穿(chuan)過間隙。LNP的(de)(de)(de)尺寸通(tong)常通(tong)過改變PEG脂(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)量(liang)或(huo)混(hun)合參(can)數（如流速(su)和(he)體積(ji)比(bi)）來調(diao)節。LNPs的(de)(de)(de)尺寸可能會影響其(qi)內吞、生物分(fen)布、降解和(he)清除，不同的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)(yong)(yong)可能需要(yao)不同的(de)(de)(de)粒(li)徑(jing)。例如，45 nm的(de)(de)(de)siRNA LNPs在皮下給藥時(shi)最有效(xiao)，而80 nm 的(de)(de)(de)siRNA LNPs在小鼠(shu)靜脈(mo)給藥時(shi)最有效(xiao)。然而，對(dui)(dui)嚙齒動(dong)物和(he)非人靈長類動(dong)物中各種(zhong)(zhong)粒(li)徑(jing)mRNA-LNP的(de)(de)(de)對(dui)(dui)比(bi)表明，非人靈長類動(dong)物肌肉注射時(shi)對(dui)(dui)LNPs粒(li)徑(jing)不太敏感。

LNP依靠(kao)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)與(yu)細胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)和生物環境進行相(xiang)互(hu)作用。由于(yu)細胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)帶(dai)(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)，表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)帶(dai)(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)LNPs會(hui)被細胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)排斥從而不(bu)被細胞(bao)(bao)(bao)吸(xi)收。另一方面(mian)(mian)，帶(dai)(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)LNPs可(ke)能會(hui)直(zhi)接破壞細胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)，引起細胞(bao)(bao)(bao)毒性(xing)(xing)。這(zhe)就(jiu)凸(tu)顯了(le)可(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)離(li)(li)(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)在(zai)LNP設計中(zhong)的(de)(de)重要性(xing)(xing)：最初，含有(you)可(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)離(li)(li)(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)LNP是中(zhong)性(xing)(xing)的(de)(de)，可(ke)以避免任何(he)不(bu)必要的(de)(de)靜電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)相(xiang)互(hu)作用，但在(zai)酸性(xing)(xing)內體pH環境下會(hui)帶(dai)(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)。LNPs的(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)通(tong)常(chang)用zeta電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)位測量(liang)來評估，該(gai)技術通(tong)常(chang)用于(yu)評估膠體聚(ju)集，盡管沒有(you)嚴格(ge)的(de)(de)分類，但如(ru)果(guo)zeta電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)位落在(zai)-20和+20 mV之間(jian)，則(ze)認(ren)為(wei)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)較弱。調整LNPs總(zong)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)一種常(chang)見方法(fa)是調整N/P比(bi)或者(zhe)說電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)離(li)(li)(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)（N代(dai)表(biao)(biao)(biao)(biao)陽離(li)(li)(li)子胺）與(yu)核酸（P代(dai)表(biao)(biao)(biao)(biao)陰(yin)離(li)(li)(li)子磷酸鹽）的(de)(de)比(bi)值。Carrasco等(deng)認(ren)為(wei)，增(zeng)加含有(you)可(ke)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)離(li)(li)(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)KC2的(de)(de)LNPs中(zhong)的(de)(de)N/P比(bi)可(ke)以增(zeng)加表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)和封裝(zhuang)效率。有(you)趣(qu)的(de)(de)是，在(zai)LNPs中(zhong)加入永(yong)久帶(dai)(dai)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)的(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)時可(ke)能在(zai)不(bu)增(zeng)加表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)情(qing)況下改變(bian)優先攝取的(de)(de)器官(guan)。Cheng等(deng)基于(yu)脂(zhi)質(zhi)(zhi)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)在(zai)小鼠中(zhong)實現(xian)了(le)選擇性(xing)(xing)器官(guan)靶向(xiang)（SORT）：向(xiang)LNP配方中(zhong)添加帶(dai)(dai)正(zheng)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)可(ke)實現(xian)肺組織的(de)(de)優先轉染(ran)(ran)，而帶(dai)(dai)負(fu)電(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)則(ze)將轉染(ran)(ran)導向(xiang)脾(pi)臟。

脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)封(feng)包(bao)可(ke)(ke)能(neng)會影響(xiang)從膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)水(shui)化和(he)變(bian)(bian)形能(neng)力到(dao)(dao)細胞攝(she)取(qu)和(he)核(he)(he)(he)酸(suan)釋放等許多(duo)參(can)數。最(zui)近的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)篇綜述(shu)總結(jie)了形成(cheng)(cheng)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)囊泡所(suo)(suo)需的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)(de)(de)(de)基礎知識。簡(jian)單(dan)地說，每種(zhong)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)都可(ke)(ke)以(yi)用一(yi)(yi)個封(feng)包(bao)參(can)數來描述(shu)，該參(can)數取(qu)決于(yu)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)極(ji)性“頭”和(he)非(fei)極(ji)性“尾(wei)(wei)”所(suo)(suo)占(zhan)的(de)(de)(de)(de)體(ti)積。結(jie)構平衡(heng)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)形成(cheng)(cheng)柱狀(zhuang)結(jie)構和(he)層(ceng)狀(zhuang)相(xiang)，而“不(bu)平衡(heng)”結(jie)構則(ze)形成(cheng)(cheng)六方(fang)、立(li)方(fang)和(he)膠束相(xiang)。倒置的(de)(de)(de)(de)六方(fang)相(xiang)（HII）表(biao)現(xian)出(chu)最(zui)顯著的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)膜(mo)(mo)融合(he)促進(jin)作用。到(dao)(dao)目前為止，非(fei)層(ceng)狀(zhuang)相(xiang)的(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)控制(zhi)備在RNA-LNP遞送領(ling)域仍然是相(xiang)對少見的(de)(de)(de)(de)，納米立(li)方(fang)液(ye)晶是最(zui)突(tu)出(chu)的(de)(de)(de)(de)例子(zi)。然而，LNPs在暴(bao)(bao)露(lu)于(yu)環境(jing)誘(you)因時可(ke)(ke)能(neng)發(fa)生(sheng)結(jie)構變(bian)(bian)化。Heyes等利(li)用核(he)(he)(he)磁共(gong)振波譜(pu)（P NMR）研究了含有(you)一(yi)(yi)系列具有(you)不(bu)同(tong)脂(zhi)(zhi)尾(wei)(wei)的(de)(de)(de)(de)陽離子(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)顆粒的(de)(de)(de)(de)相(xiang)變(bian)(bian)行為，發(fa)現(xian)層(ceng)狀(zhuang)到(dao)(dao)倒置六方(fang)相(xiang)轉變(bian)(bian)溫度(du)（TBH）較低的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)具有(you)更好的(de)(de)(de)(de)融合(he)促進(jin)能(neng)力，這一(yi)(yi)點在基因沉默效(xiao)率上得到(dao)(dao)了證明。同(tong)樣，其中(zhong)一(yi)(yi)個膜(mo)(mo)不(bu)穩定(ding)理論提出(chu)，當(dang)可(ke)(ke)電離脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)暴(bao)(bao)露(lu)于(yu)晚期(qi)核(he)(he)(he)內體(ti)的(de)(de)(de)(de)酸(suan)性pH時，可(ke)(ke)電離脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)與核(he)(he)(he)內體(ti)膜(mo)(mo)內磷脂(zhi)(zhi)之間的(de)(de)(de)(de)靜電相(xiang)互(hu)作用會導(dao)致膜(mo)(mo)破裂。Liu等最(zui)近的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)項工作基于(yu)這一(yi)(yi)概念，報道了利(li)用核(he)(he)(he)磁共(gong)振波譜(pu)得到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)種(zhong)新型可(ke)(ke)電離脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)暴(bao)(bao)露(lu)于(yu)核(he)(he)(he)內體(ti)模擬物時倒置六方(fang)相(xiang)形成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)證據。雖(sui)然pH誘(you)導(dao)關聯是脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)材料最(zui)常(chang)見的(de)(de)(de)(de)機制(zhi)，但(dan)在我們最(zui)近的(de)(de)(de)(de)綜述(shu)中(zhong)討論了其他導(dao)致核(he)(he)(he)內體(ti)膜(mo)(mo)不(bu)穩定(ding)的(de)(de)(de)(de)路徑。

由于(yu)脂(zhi)質(zhi)(zhi)相(xiang)(xiang)和整體極性(xing)的(de)(de)(de)不同(tong)，脂(zhi)膜(mo)可能(neng)會(hui)(hui)(hui)捕獲水(shui)從而改變(bian)膜(mo)的(de)(de)(de)流動性(xing)或變(bian)形(xing)性(xing)，這可能(neng)會(hui)(hui)(hui)影(ying)響(xiang)脂(zhi)膜(mo)融合(he)(he)。膜(mo)水(shui)合(he)(he)作用也可能(neng)影(ying)響(xiang)對(dui)(dui)pH的(de)(de)(de)潛在(zai)響(xiang)應，而pH通(tong)常作為啟動核酸(suan)釋放的(de)(de)(de)一(yi)個(ge)重(zhong)要環境(jing)誘因(yin)。LNP在(zai)其(qi)生命周期中(zhong)所涉及的(de)(de)(de)pH波動如(ru)圖(tu)4所示。當LNPs進(jin)入(ru)細胞內(nei)空間時，它們被束縛(fu)在(zai)核內(nei)體中(zhong)，而核內(nei)體在(zai)成熟(shu)為溶(rong)酶體時會(hui)(hui)(hui)逐漸酸(suan)化(hua)(hua)。因(yin)此(ci)，脂(zhi)質(zhi)(zhi)膜(mo)內(nei)較(jiao)高(gao)(gao)的(de)(de)(de)含水(shui)量(liang)可能(neng)會(hui)(hui)(hui)影(ying)響(xiang)酸(suan)化(hua)(hua)動力(li)(li)學，并(bing)有加速膜(mo)的(de)(de)(de)失穩(wen)。Koitabashi等通(tong)過Laurdan實驗(yan)研(yan)究了siRNA-LNPs中(zhong)pH值對(dui)(dui)脂(zhi)膜(mo)穩(wen)定(ding)性(xing)的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)，發現膜(mo)水(shui)合(he)(he)作用與基因(yin)沉默效率呈正相(xiang)(xiang)關(guan)；然而，該研(yan)究并(bing)未關(guan)注酸(suan)化(hua)(hua)動力(li)(li)學。關(guan)于(yu)膜(mo)水(shui)合(he)(he)有一(yi)個(ge)有意思的(de)(de)(de)現象，核磁共(gong)振波譜結果(guo)表明，siRNA-LNPs比(bi)(bi)(bi)相(xiang)(xiang)同(tong)配方的(de)(de)(de)mRNA-LNPs的(de)(de)(de)含水(shui)量(liang)更(geng)少，這可能(neng)是因(yin)為親(qin)水(shui)RNA鏈的(de)(de)(de)長(chang)度更(geng)長(chang)。Carrasco等進(jin)一(yi)步證明了這些(xie)觀點，他(ta)們發現低(di)N/P比(bi)(bi)(bi)的(de)(de)(de)KC2 LNPs單個(ge)納米顆粒中(zhong)包含更(geng)多的(de)(de)(de)mRNA和脂(zhi)質(zhi)(zhi)，并(bing)且(qie)有較(jiao)高(gao)(gao)的(de)(de)(de)介電常數，認為低(di)N/P比(bi)(bi)(bi)的(de)(de)(de)LNPs比(bi)(bi)(bi)高(gao)(gao)N/P比(bi)(bi)(bi)的(de)(de)(de)LNPs更(geng)易水(shui)合(he)(he)。更(geng)高(gao)(gao)的(de)(de)(de)RNA載量(liang)也會(hui)(hui)(hui)使轉染(ran)得到改善。因(yin)此(ci)，mRNA-LNPs可能(neng)對(dui)(dui)環境(jing)變(bian)化(hua)(hua)更(geng)敏(min)感(gan)，盡管(guan)pH敏(min)感(gan)性(xing)的(de)(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)可能(neng)與生物(wu)過程的(de)(de)(de)時間尺度無關(guan)。暴露在(zai)生物(wu)環境(jing)中(zhong)的(de)(de)(de)重(zhong)組進(jin)一(yi)步使LNP殼水(shui)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)問題變(bian)得復雜(za)。

圖4 LNP生命周(zhou)期中涉及的pH變化(hua)

LNPs固(gu)有(you)的(de)(de)水環(huan)境(jing)也對(dui)其(qi)長(chang)(chang)期(qi)穩(wen)(wen)定構成威脅。純核(he)(he)酸(suan)(suan)在環(huan)境(jing)條件下可(ke)通過(guo)外(wai)源RNase降(jiang)解或自(zi)水解迅速惡化。雖然LNPs可(ke)以(yi)(yi)保(bao)護(hu)(hu)核(he)(he)酸(suan)(suan)免(mian)受酶降(jiang)解，但(dan)它(ta)們(men)容易因為(wei)熱力(li)學因素（如(ru)最(zui)(zui)小化相(xiang)分離）聚集(ji)，可(ke)能導致納(na)米顆粒融合時核(he)(he)酸(suan)(suan)的(de)(de)丟失，最(zui)(zui)終影響轉染效率。低溫(wen)(wen)保(bao)存(cun)和(he)凍(dong)干可(ke)以(yi)(yi)保(bao)護(hu)(hu)RNA，但(dan)是(shi)冰結晶會(hui)損傷LNPs，盡(jin)管加入蔗糖等低溫(wen)(wen)保(bao)護(hu)(hu)劑似乎可(ke)以(yi)(yi)緩解這(zhe)(zhe)(zhe)個(ge)問題(ti)。有(you)趣的(de)(de)是(shi)，LNPs可(ke)能會(hui)根據儲(chu)存(cun)條件改變優(you)先攝取其(qi)的(de)(de)器官，這(zhe)(zhe)(zhe)可(ke)能是(shi)它(ta)們(men)重組的(de)(de)結果(guo)。從實(shi)踐(jian)的(de)(de)角度來(lai)看，最(zui)(zui)近開發的(de)(de)針(zhen)對(dui)COVID-19的(de)(de)mRNA-LNP疫(yi)苗(miao)為(wei)RNA療(liao)(liao)法(fa)創建了物流(liu)基(ji)礎設施，這(zhe)(zhe)(zhe)可(ke)能會(hui)消除關于(yu)LNP穩(wen)(wen)定性(xing)(xing)(xing)、存(cun)儲(chu)和(he)運(yun)輸的(de)(de)許多擔(dan)憂。這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)疫(yi)苗(miao)擁(yong)有(you)在冷凍(dong)溫(wen)(wen)度（-20°C）下長(chang)(chang)達(da)6個(ge)月的(de)(de)以(yi)(yi)及室溫(wen)(wen)下長(chang)(chang)達(da)30天的(de)(de)長(chang)(chang)期(qi)穩(wen)(wen)定性(xing)(xing)(xing)，極大地推動(dong)了這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)突破(po)性(xing)(xing)(xing)治療(liao)(liao)的(de)(de)普及。值得注意(yi)的(de)(de)是(shi)，輝瑞/BioNTech和(he)Moderna疫(yi)苗(miao)有(you)著不同(tong)的(de)(de)存(cun)儲(chu)要求(qiu)，這(zhe)(zhe)(zhe)表明(ming)LNP配方的(de)(de)變化可(ke)能會(hui)顯著改變其(qi)核(he)(he)酸(suan)(suan)親和(he)力(li)和(he)LNP穩(wen)(wen)定性(xing)(xing)(xing)。由(you)于(yu)目(mu)前還(huan)沒(mei)有(you)建立針(zhen)對(dui)這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)非晶材料(liao)的(de)(de)加速穩(wen)(wen)定性(xing)(xing)(xing)測試的(de)(de)方法(fa)，這(zhe)(zhe)(zhe)意(yi)味著，LNP穩(wen)(wen)定性(xing)(xing)(xing)只能在離散時間點進行(xing)經驗評(ping)估，差示(shi)掃描(miao)量(liang)熱法(fa)（DSC）等方法(fa)可(ke)能對(dui)LNP退化提供(gong)有(you)價值的(de)(de)參考。最(zui)(zui)后，預測基(ji)于(yu)LNP的(de)(de)RNA療(liao)(liao)法(fa)的(de)(de)下游特性(xing)(xing)(xing)需要我們(men)對(dui)LNP的(de)(de)自(zi)組裝過(guo)程有(you)更深的(de)(de)理解。

圖5 LNP結構待解決問(wen)題

5.結論和展望

LNPs是一種高度可(ke)定(ding)制(zhi)的(de)(de)(de)(de)核酸載體(ti)，在(zai)mRNA疫(yi)苗(miao)(miao)中(zhong)(zhong)顯示出巨(ju)大的(de)(de)(de)(de)潛(qian)力。我(wo)們也不應忽視(shi)它們在(zai)治(zhi)療罕見疾病和(he)癌癥方(fang)面的(de)(de)(de)(de)可(ke)能(neng)價值。mRNA治(zhi)療可(ke)以幫助(zhu)產生治(zhi)療性蛋白來恢(hui)復受損組織或器官的(de)(de)(de)(de)功能(neng)。全球開展了大量的(de)(de)(de)(de)科(ke)學(xue)研究來設(she)計和(he)細(xi)化LNPs的(de)(de)(de)(de)單個成分，以便高效(xiao)和(he)安全地遞送所(suo)關注的(de)(de)(de)(de)核酸。然而(er)(er)，LNP科(ke)學(xue)方(fang)興未艾，還有許多懸(xuan)而(er)(er)未決(jue)的(de)(de)(de)(de)問題(ti)，圖5中(zhong)(zhong)列出了其(qi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)一些。毫(hao)無疑問，公眾對mRNA疫(yi)苗(miao)(miao)的(de)(de)(de)(de)持續高漲的(de)(de)(de)(de)興趣將激(ji)勵這一領域的(de)(de)(de)(de)研究工作，我(wo)們謹(jin)慎樂觀地認為，我(wo)們正在(zai)見證(zheng)納米醫學(xue)的(de)(de)(de)(de)新時代。

原(yuan)文來源：Chemistry of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery.Acc Chem Res. 2022 Jan 4;55(1):2-12.